數(shù)字PCR是一種高靈敏度的核酸絕對定量分析技術(shù)，它繼實時熒光定量PCR之后，為科研和臨床領(lǐng)域提供了更為精確和可靠的核酸定量方法。數(shù)字PCR系統(tǒng)通過獨特的工作流程，實現(xiàn)了對核酸樣本的精確分區(qū)和擴增，從而能夠準(zhǔn)確計算出核酸拷貝數(shù)，為基因突變檢測、拷貝數(shù)變異分析、病毒微生物檢測等領(lǐng)域提供了強大的技術(shù)支持。
一、工作流程
數(shù)字PCR系統(tǒng)的工作流程包括樣本制備、反應(yīng)體系制備、分區(qū)或微滴生成、封蓋和熱循環(huán)、熒光信號檢測以及數(shù)據(jù)分析等步驟。
1、樣本制備：
這是數(shù)字PCR的第一步，涉及從生物樣本中提取DNA或RNA，或者使用已經(jīng)制備好的核酸樣本。樣本的質(zhì)量和純度對后續(xù)的實驗結(jié)果至關(guān)重要，因此，這一步需要嚴(yán)格遵循實驗操作規(guī)程，確保樣本的完整性和代表性。
2、反應(yīng)體系制備：
根據(jù)數(shù)字PCR儀器和試劑的要求，制備包含引物、探針、dNTPs（脫氧核糖核苷酸三磷酸）、酶和緩沖液等的反應(yīng)體系。這一步驟要求精確控制各組分的比例和濃度，以保證PCR反應(yīng)的順利進行和擴增效率。
3、分區(qū)或微滴生成：
將制備好的反應(yīng)體系分配到大量的微小分區(qū)或微滴中。這些分區(qū)或微滴是通過微流控技術(shù)、油包水乳化或其他方法生成的，每個分區(qū)或微滴都包含有反應(yīng)所需的全部組分，且相互獨立。這一步驟是實現(xiàn)高精度和高靈敏度的基礎(chǔ)。
4、封蓋和熱循環(huán)：
將分區(qū)或微滴進行封蓋，以防止在熱循環(huán)過程中的液體蒸發(fā)和污染。隨后，進行PCR熱循環(huán)，使目標(biāo)核酸在每個分區(qū)或微滴中進行擴增。熱循環(huán)過程中，通過精確控制溫度和時間，確保目標(biāo)核酸的有效擴增。
5、熒光信號檢測：
在熱循環(huán)過程中，使用熒光染料或探針來監(jiān)測目標(biāo)核酸的擴增。當(dāng)目標(biāo)核酸被擴增時，熒光信號強度會相應(yīng)增加。每個分區(qū)或微滴中的熒光信號強度與其中存在的目標(biāo)核酸數(shù)量成正比，這為后續(xù)的定量分析提供了依據(jù)。
6、數(shù)據(jù)分析：
使用專門的軟件或分析方法，對每個分區(qū)或微滴的熒光信號進行分析。根據(jù)泊松分布和陽性比例，計算出核酸拷貝數(shù)，實現(xiàn)定量分析。這一步驟需要強大的數(shù)據(jù)處理能力和統(tǒng)計分析技能，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
二、優(yōu)勢
1、高精度：
數(shù)字PCR技術(shù)通過將反應(yīng)體系分配到大量獨立的分區(qū)或微滴中，使得每個分區(qū)或微滴中的核酸拷貝數(shù)相對固定且可計數(shù)。這種方法避免了傳統(tǒng)PCR中由于模板濃度不均一而導(dǎo)致的誤差，從而實現(xiàn)了對核酸拷貝數(shù)的精確測量。因此，在基因表達、基因突變檢測等領(lǐng)域具有更高的精度和可靠性。
2、高靈敏度：
它能夠檢測到非常低濃度的核酸樣本，甚至能夠檢測到單個拷貝的核酸分子。這種高靈敏度使得數(shù)字PCR在病毒檢測、腫瘤標(biāo)志物檢測等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。同時，還能夠通過優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，進一步提高檢測靈敏度，滿足更多領(lǐng)域的需求。
3、無需標(biāo)準(zhǔn)曲線：
傳統(tǒng)PCR技術(shù)通常需要通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來進行定量分析，而數(shù)字PCR技術(shù)則無需這一步驟。因為數(shù)字PCR是根據(jù)每個分區(qū)或微滴中的熒光信號強度來計算核酸拷貝數(shù)的，因此無需依賴外部標(biāo)準(zhǔn)品進行校正。這一特點簡化了實驗操作流程，減少了實驗誤差，提高了實驗效率。
4、多重檢測能力：
可以在單個PCR反應(yīng)中同時檢測多種核酸序列。這使其在復(fù)雜樣本的分析中更具優(yōu)勢，能夠同時獲取多種目標(biāo)核酸的信息，提高了實驗的效率和準(zhǔn)確性。
5、高耐受性：
對抑制劑和污染物的耐受性較高，能夠在復(fù)雜的環(huán)境中進行穩(wěn)定的PCR擴增。這使得數(shù)字PCR在實際應(yīng)用中更具靈活性和適應(yīng)性，能夠應(yīng)對各種復(fù)雜的實驗條件。
